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First Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser

First Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser

产品编号:4203

产品规格:50*20ul/100*20ul/1000*20ul

产品价格:750/1290/10900

包装:

储存条件:F

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First Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser

产品介绍:

本产品是一种高效、稳定、快速并可以去除基因组DNA污染的反转录系统。本试剂盒为一管式反转录预混Mix,5 × TRUE RT MasterMix 中含有反转录第一链合所需的所有试剂(TRUEscript Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、Buffer)。 通常Real Time RT-PCR等实验需要先用DNase I消化去除RNA中残留的基因组DNA(gDNA) ,但是传统DNase I 处理复杂并容易造成 RNA 的降解和损失。本试剂盒中使用了具有DNA分解活性的特殊 4 × gDNA Eraser Mix 2分钟消除gDNA残留,不需要DNase 消化和后续繁琐步骤。 


产品存储:-20℃ 保存,有效期12个月

适用范围:第一链cDNA合成去除RNA中残留的gDNA可用于高拷贝、低拷贝基因的检测。

产品特点:

不需要传统繁琐的DNase I消化,采用gDNA Eraser Mix极大简化了DNA残留的清除流程。全预混的反转录mix和gDNA Eraser Mix大大减少了加样工作量和降低RNA污染几率。同时2种mix在-20℃不冻结可以直接使用,节约了化冻和混匀时间,使用方便。 特殊优化的oligo dT和N6随机引物配比,使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的逆转录效率,最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。反转录效率高。只需42℃,20 min即可完成cDNA第一链的合成。合成cDNA片段长度最高可达12 kb。


操作步骤:

第一链cDNA合成(以20 μl反应体系为例)
1.在RNAse free管里面加入以下成分:(建议使用PCR管并在PCR仪器上进行)

Components Volume
Total RNA/mRNA ≤ 12 μl *
4 × gDNA Eraser Mix 4 μl (见注意事项3)
RNase free H2O to final volume  to 16 μl(补足到总体积16 μl)

* Total RNA不超过2 μg,mRNA不超过200 ng (20μl体系)


2. 轻轻混匀,42℃孵育2分钟(或者37℃孵育5分钟)。



3. 瞬间离心收集反应液至管底,置冰上,继续在同一管加入如下成份:

Components Volume
5 × TRUE RT MasterMix 4 μl (见注意事项3)

4. 轻轻混匀(总体积20 μl)
如使用mRNA模板是来源于真核细胞(如人、小鼠的组织细胞)含有Poly(A)尾结构,42℃孵育15-20 min。


如使用mRNA模板是来源于原核细胞(细菌)或者病毒等不含Poly(A)尾结构,25℃孵育10 min,42℃孵育15-20 min。


5. 85℃加热 5 min 失活TRUEscript Hˉ RTase和gDNA Eraser。


6. 置冰上,合成的cDNA可以用于下一步荧光定量PCR。需较长时间保存时,请于-70℃保存,避免反复冻融。

RT-qPCR:

取1/10-1/5 体积(2-4 μl)的反转录产物作为PCR模板或者根据需求调节使用量。若后续实验为实时荧光定量PCR,逆转录产物的加量应不超过PCR体系终体积的1/10,例如50 μl 的PCR反应体系,逆转录产物的加量应不超过5 μl。按照厂家荧光定量PCR试剂说明书进行下一步荧光定量PCR。

注意事项:
1. 避免RNase污染。
2. 为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。
3. 4 × gDNA Eraser Mix 、5 × TRUE RT MasterMix  非常粘稠,溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失,用前请点甩离心后使用,并且避免吸头外壁沾附损失。