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2 x SYBR Green qPCR Mix (抗体修饰,含Rox)

2 x SYBR Green qPCR Mix (抗体修饰)

产品编号:4302

产品规格:1ml/5ml

产品价格:300/1200

包装:

储存条件:F

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2 x SYBR Green qPCR Mix  (抗体修饰,含Rox)

产品介绍:

本体系是用于染料法(SYBR Green I)实时荧光定量的预混体系。产品含有优化浓度的HotStart Taq DNA Polymerase、dNTPs、Mg2+、反应缓冲液和稳定剂等成分。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA靶序列的检测,如基因表达分析,拷贝数分析,适用于不同类型荧光定量PCR。


本体系为2×SYBR Green qPCR(Antibody)专用预混液,使用时只需加入模板、引物和水,使其工作浓度为1×,即可进行反应。精心研制的抗体法热启动Taq酶,配合反复优化的Buffer,增强了在低浓度和复杂模板上的扩增效率,具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点,可最大限度地减少人为误差、节约PCR实验操作时间、降低污染几率。


产品存储:

20 ℃ 避光保存至少6个月,使用前充分融解混匀。短期使用可放在4 ℃,避免反复冻融。


产品特点:

1. 适用于2×SYBR Green qPCR专用预混液,可以快速,准确地对目的基因进行分析,如基因表达分析,拷贝数分析,适用于不同类型荧光定量PCR。

2. 即用型2×预混荧光定量mix,PCR反应配置时,只需加入预先设计好的上下游引物,模板和灭菌蒸馏水即可进行反应,使用方便。

3. 95℃ 3min完全热启动,完全避免了非特异性反应的发生,配合反复优化的Buffer,增强了在低浓度和复杂模板上的扩增效率,具有扩增效率高,扩增灵敏度高,扩增特异性好等特点。


实验步骤:

1.反应液的配置分装,务必使用无污染的新吸头,EP管,尽量避免污染。


2.溶解所有用到的试剂,轻柔上下颠倒混匀,短暂瞬时离心将溶液甩至管底;


3.按下列组份配制qPCR混合液,将除模板以外的试剂混成mix,再分装到单个PCR管内,最后加入模板DNA。


建议PCR条件:(以25,50 μl反应体系为例,反应液配制请在冰上进行)

Components Volume20 μl Volume25 μl
2 x SYBR Green qPCR Mix 10 μl 12.5μl
DNA Template  1-2 μl 1-2.5 μl
Forward Primer (10 μM)  0.4 μl 0.5 μl
Reverse Primer (10 μM)  0.4 μl 0.5 μl
ddH2O to final volume  20 μl 25 μl


4.短暂瞬时离心后放入荧光定量PCR仪中运行,qPCR反应程序如下:

两步法流程
温度
时间
循环数
检测荧光
预变性
95℃
3 min
1x
Off
变性
95℃
10-15 sec
40x
Off
退火-延伸
60℃
30 sec
On
60-95℃溶解曲线阶段

*当两步法扩增效率不好的时候建议选择三步法进行qPCR反应:

两步法流程
温度
时间
循环数
检测荧光
预变性
95℃
3 min
1x
Off
变性
95℃
10 sec
40x
Off
退火
60℃
20 sec
Off
延伸
72℃
30 sec
On
60-95℃溶解曲线阶段

说明:本制品兼容性强,适用于不同厂家、型号的荧光定量PCR仪,绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。在实际使用中可以根据机型推荐和具体情况对程序加以微调。一般来说,二步法扩增特异性高,三步法扩增效率高。如果融链曲线较差,可以尝试两步法扩增;若因使用Tm值较低的引物等原因,得不到良好的实验结果时,可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。


注意事项:

1.反应液的配置分装,务必使用无污染的新吸头,EP管,尽量避免污染。
2.解冻2 x SYBR Green qPCR Mix(Antibody),上下颠倒轻轻混匀混合,避免气泡,瞬时低速离心后使用。
3.引物终浓度应在0.1-0.6μM之间进行调节。一般情况下,终浓度为0.2μM的引物可以得到较好的结果;
4.模板量:对于基因组DNA模板量用量10ng-100ng;对于模板是反转后得到的cDNA,使用体积不超过qPCR反应液总体积的1/10,即20ul体系建议最多加入2ul cDNA,以此类推。
5.变性时间设置:建议预变性时间设为95℃,3min,复杂或高GC模板适当延长时间至5 min,变性时间设为95℃,10 sec,具体可根据实验调整。
6.退火温度和时间设置:请根据引物的Tm值和目的基因的长度进行调整,退火温度和时间设置。
7.50×ROX Reference Dye用于校正加样孔之间的体积误差和荧光信号误差,不用Reference Dye校正的qPCR扩增仪器,使用时无需添加ROX。使用于以下荧光定量仪器,50×ROX Reference Dye使用方法如下:

仪器名称
使用终浓度
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT和StepOne / StepOne Plus 等
终浓度1×(High ROX)
ABI 7500/7500 Fast,Agilent Mx3000P/Mx3005P/Mx4000等
终浓度0.1×(Low ROX)
Roche仪器,Bio-Rad仪器,Eppendorf仪器,上海宏石,FS福生仪器等
无需添加ROX
8.qPCR实验时,在配置反应孔Mix之前,每1ml Mix中加入40ul 50×ROX或者4ul 50×ROX(qPCR实验仪器型号决定加入体积),用1ml移液器轻轻混匀。