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Trizol总RNA提取试剂盒​(RNASure Reagent)

RNASure Reagent是一种即用型总RNA抽提试剂,可以快速提取人、动物、植物、酵母和细菌等不同组织或细胞的总RNA,对少量的50-100 mg组织和5×106细胞,以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。操作简单可同时处理多个的样品,所有的操作能在一小时内完成。

产品编号:2101

产品规格:25ml/50ml/100ml

产品价格:270/468/860

包装:

储存条件:4℃

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Trizol总RNA提取试剂盒(RNASure Reagent)


一. 产品介绍:

Trizol总RNA提取试剂盒是一种即用型总RNA抽提试剂,可以快速提取人、动物、植物、酵母和细菌等不同组织或细胞的总RNA,对少量的50-100 mg组织和5×106细胞,以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。操作简单可同时处理多个的样品,所有的操作能在一小时内完成。

Trizol总RNA提取试剂盒含有苯酚、异硫氰酸胍等成分,能在裂解样品时迅速破碎细胞,溶解细胞内含物并抑制细胞释放出的核酸酶,同时保持RNA的完整性。研磨后的组织样品加入RNASure Reagent,样品完全匀浆或裂解后,加入氯*后离心,样品分成:上层无色含RNA的水样层,白色中间层和下层红色的苯酚-氯*有机层。收集上面的水样层,通过异丙醇沉淀来提取RNA,通过乙醇沉淀从中间层和有机层提取DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

抽提的总RNA没有DNA和蛋白的污染,可用于Northern blot、Dot Blot、RT-PCR、poly(A)+ selection、In tro translation、RNase protection assay and molecular cloning等实验。如果是用于PCR,当两条引物位于单一外显子时,建议用扩增级的DNase I来处理抽提的总RNA。

RNASure能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如,从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色,可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带(mRNA和hnRNA成分),两条优势核糖体~5 kb (28S)和~2 kb(18S),低分子量RNA介于0.1和0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8。

二. 适用范围:

适用于各种动植物组织/细胞总RNA、DNA、蛋白的快速抽提。


三. 储存条件:

在室温下能够稳定保存12个月,为达到最佳效果,建议在4℃冰箱中冷藏保存。


四. 注意事项:
1. 安全提示:抽提RNA时要戴手套和护眼罩,避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作,避免呼吸道吸入,所有的操作应在15-30℃的条件下。有毒物接触皮肤或者不慎吞服,会导致灼伤,一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。若感不适,看医生并寻求苯酚和其他成分的正确治疗方案。
2. 实验过程中,经常更换新手套,并使用灭菌的,无RNase的一次性塑料制品和枪头,避免RNase污染。
3. RNA在RNASure中不会被RNase降解,但提取后的处理过程需使用不含RNase的玻璃器皿或塑料制品,玻璃物品在150℃烘烤4小时,塑料制品在0.5 M NaOH溶液中浸泡10min,然后用水冲洗,再高压灭菌,80℃烘烤干燥后,置于干净处待用。
4. 配置溶液应使用RNase-free ddH2O(将水加入干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(v/v),放置过夜,高压灭菌),如配置75%乙醇需用RNase-free ddH2O配置。
5. 在匀浆后和加入氯*之前,样品在-60~-70℃保存至少一个月,RNA沉淀溶于75%乙醇在2-8℃至少保存一周,在-5~-20℃下至少保存一年。


五. 操作步骤:
1、自备物品:
*,异丙醇,75%乙醇(RNase-Free ddH2O配制),RNase-free ddH2O

2、匀浆化作用(Homogenizing Samples)
2.1.组织:
用glass-Teflon或匀浆器搅匀组织样品,以新鲜植物叶片或幼嫩根茎组织为例,在液氮中充分研磨成粉末或者用剪刀剪碎后直接加RNASure试剂迅速研磨。以新鲜或-70℃冻存的鼠肝脏组织为例,可用液氮或匀浆仪迅速匀浆处理,每50-100mg组织加1ml的RNASure,匀浆化时组织样品容积不能超过RNASure容积的10%。可选方案:当样品富含蛋白质,脂肪,多糖或是细胞外物质,例如肌肉,脂肪组织和植物的块茎部分可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在2-8℃的条件下以12000x g离心10min,上清液含有RNA,移除匀浆中不溶解的物质,如脂肪组织,大量的脂肪飘在最上层必需除掉,余下的沉淀中包含有细胞外膜,多糖,以及高分子量DNA。在每一个个案中,将清亮的富含RNA的上清溶液转移到一干净的试管中,加入氯*并继续进行下述的分离步骤。如果需要提取后续的DNA,则不能用此可选方案。

2.2.单层培养的细胞(Adherent Cells/Monolayer):
单层贴壁细胞的收集:可直接在培养容器中裂解,或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。(在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法)。
(1)培养皿直接裂解法:吸除培养基,直接往直径35mm培养皿中加入1ml 的RNASure溶解细胞,用移液管多次吹打,分次移出细胞裂解物。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的RNASure试剂量,每10cm2加1ml RNASure试剂,一般35mm dish加1ml,60mm dish加3ml,100mm dish加8ml,当加入量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。
(2)胰蛋白酶处理法:确定细胞数量,吸除培养基,用PBS洗涤细胞,吸除PBS,向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞,当细胞脱离容器壁时,加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶,将细胞溶液转移至RNase-free的离心管中,300×g离心5 min,收集细胞沉淀,仔细吸除所有上清。注意:收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净,否则会导致裂解不完全,造成RNA的产量降低。

2.3.悬浮生长的细胞:
通过离心来收集细胞,吸取培养基,每0.25ml样品(5-10x106的动物,植物或酵母细胞或1x107细菌)加入0.75ml 的RNASure,在加入RNASure前应避免洗涤细胞,因为那样会增加mRNA降解的可能性,用移液管反复吹打来裂解细胞,破裂某些酵母菌和细菌细胞可能需要使用匀浆器。匀浆化的样品能够在室温放置数小时,在-60-70℃保存至少一个月。


3、分离阶段(Phase Separation)
将匀浆样品在15-30℃条件下孵育5min以使核蛋白体完全分离,每1ml RNASure加0.2ml氯*,盖紧样品管盖,用力摇晃试管15秒并将其在室温下孵育2-3min,在2-8℃下以不超过12000 x g 的离心力高速冷冻离心15min。离心后混合物分成三层:下层红色的苯酚-氯*有机层,中间层和上层无色的水样层。RNA存在于水样层中,水样层约占总体积的50-60%,倾斜45度吸取上层无色水样层到干净的试管中,避免吸到中间层和有机层,如果需要分离DNA和蛋白,中间层和有机层同样要予以保留。

4、RNA的沉淀
将收集到的水样层和异丙醇混合来沉淀RNA,按照最初匀浆化时的每1ml RNASure对应加0.5ml 异丙醇,将混合的样品在15-30℃条件下孵育10min,之后在2-8℃以不超过12000 x 的离心力高速冷冻离心10min,RNA沉淀在离心前通常不可见,形成一胶片状沉淀附着于试管壁和管底。


可选方案:从少量组织(1-10mg)或细胞(102-104)中分离RNA,往组织或细胞中加入800ul RNASure,待样品裂解后,加入氯*并进行分离阶段抽提操作(为降低匀浆黏度可在加入氯*前用200ul黄枪头吹吸几次以切断基因组DNA),在用异丙醇沉淀RNA之前,加入5-10ug无RNA酶的glycogen作为水样层的载体,glycogen会留在水样层中并和RNA共沉淀析出,glycogen浓度≤4mg/ml是不会抑制下游的逆转录反应第一链的合成,也不会抑制PCR反应。

5、RNA的漂洗
移去上层悬液,用75%乙醇(用RNAase-free ddH2O配制)洗涤RNA沉淀一次(保存在75%乙醇中的RNA沉淀在4℃至少可以保存一周,在-20℃下至少可保存一年),每1ml 的RNASure至少加1ml 的75%乙醇。漩涡振荡混合样品并在2-8℃下以不超过7500 x g 的离心力高速冷冻离心5min,倒掉洗液,注意不要倒出RNA沉淀,剩余的少量液体短暂离心后用枪头吸出,不可吸出RNA沉淀。

6、RNA的再溶解
室温晾干RNA沉淀(空气干燥2-3min),不能让RNA沉淀完全干燥,那样会极大地降低它的可溶性,部分溶解的RNA样品A260/280比值﹤1.6。重新溶解RNA,加入20-50ul RNase-free ddH2O或0.5%SDS溶液,反复吹打混匀,充分溶解RNA并保存在-70℃(如果RNA后续要用于酶切反应时,避免使用0.5%SDS溶液溶解)。


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送样要求:

1. 细胞(≥106 )、新鲜动植物组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、叶片(≥100mg)等样品材料,基因组DNA或总RNA(总RNA>2μg,体积≥20μl,浓度≥100 ng/μl)。
2. 靶基因信息和背景资料:基因序列或GenBank Accession Number等,生物物种信息(Human、Mouse、Rat 等)、DNA/RNA 来源、基因丰度等。

提供服务:
引物探针设计合成,RNA提取,反转录,RNA电泳,引物筛选,上机定量检测。

提交结果:
原始数据(CT值和各种统计值,融化温度图,扩增曲线图,电泳图,柱状图)、数据分析结果及详细实验报告。