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EASY多糖多酚/复杂植物RNA提取试剂盒|RNA提取

产品编号:2117

产品规格:50次

产品价格:1896

包装:

储存条件:4℃

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EASY多糖多酚/复杂植物RNA提取试剂盒(离心柱型)


一.产品介绍:
独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶, 离心沉淀去除多糖多酚和次级代谢产物,然后裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱,然后RNA被选择性洗脱滤过, 吸附在基因组DNA清除柱上的残留DNA无法洗脱连同柱子一起丢弃从而清除掉DNA。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除, 最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。基因组DNA清除柱可以有效清除gDNA残留,得到的RNA一般不需要DNase消化,可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。

二.产品特点:
1.无需使用有毒的苯酚/氯*,无需乙醇沉淀步骤。
2.简捷,单个样品操作一般可在25分钟内完成。
3.基因组DNA清除柱可以有效清除gDNA残留,得到的RNA一般不需要DNase消化,可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
4.可以提取包括复杂中草药如石斛/丹参/雪莲/人参、复杂淀粉种子如水稻/小麦/玉米种子、复杂果实如葡萄/蓝莓/草莓/西瓜果实、复杂抗逆植物如冬青/松针/沙棘/胡杨、复杂花卉月季/玫瑰/梅/牡丹花、复杂多糖植物紫菜/仙人掌/芦荟水稻种子等数百种国内外试剂盒提取失败的样品。
5.多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.9~2.2,基本无DNA残留,可用于RT-PCR,Northern-blot,二代测序和各种实验。

三.适用范围:
适用于从复杂多糖多酚,色素淀粉含量大植物组织中快速提取纯化高品质RNA,无需有毒的苯酚/氯*抽提/乙醇沉淀,基因组DNA清除柱有效清除电泳可见gDNA残留,无需DNase消化无残留DNA,可直接做荧光定量PCR,适合于对纯度要求很高的下游实验。

可以提取以下植物:
矮牵牛,白杨,百合,本草植物,播娘篙,草莓,茶梅花瓣,冬青,大白菜,大豆,大叶藻,丹参,东南景天,短莛飞蓬,番茄,番茄叶,柑橘,葛根,海棠,海藻,红花玉兰,红叶甜菜,胡杨,花生,黄鹌菜,菊花,菌丝酵母,梨,毛白杨,毛果杨,毛泡桐,毛桃,玫瑰,玫瑰花,梅花,猕猴桃,棉花,牡丹,木本植物,木瓜,拟南芥,苹果,荞麦,青杄,人参,水稻,砂生槐,山苍子,石斛,桃果实、花、根、叶,甜樱桃,芜菁,梧桐,五倍子,香樟,星花木兰,雪莲,玉米,烟草,洋葱,洋葱根、茎、蕾、叶、雌雄蕊等各部位,樱桃花、叶、颚等各部位,油茶,油茶果实,油松及果实,月季,栀子,紫菜,小麦。

四.储存条件:
1.不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.注意事项:
1.所有的离心步骤均可在室温完成(4℃离心也可以),使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.需要自备β-巯基乙醇,乙醇,研钵(可选)。
3.样品处理量绝对不要超过基因组清除柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力,否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时,如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量,将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
4.裂解液CLB和RLT Plus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.关于DNA 的微量残留:
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留),本公司的EASYspin Plus RNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术,绝大多数DNA已经被清除,不需要DNase消化,可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
1)选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3)将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup) ,请联系我们索取具体操作说明书。
4)在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I柱上消化处理。购买DNA酶柱上消化试剂盒(货号:2127)前可先索取具体操作说明书。

六.操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!
取1ml裂解液 CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解),在裂解液CLB中加入5% β-巯基乙醇(1ml CLB加50μl β-巯基乙醇)。颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。

1.直接研磨法(实验室无液氮情况下或者柔软易研磨植物样品推荐此法):
a.新鲜植物组织或者冰冻保存样品称重后取100-200mg(水分少的样品如叶片种子等可加100-150mg,水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些)迅速剪成小块放入研钵,加入 1ml CLB(已加有β-巯基乙醇)室温下充分研磨成匀浆,注意应该迅速研磨让组织和裂解液CLB立刻充分接触以抑制RNA酶活性。β-巯基乙醇是裂解液CLB的关键成分,必要的时候可以提高终浓度到10-20%。如果特别复杂植物,可以尝试在裂解液中加入PVP40至终浓度2%。

b.将裂解物转入离心管,立即剧烈振荡15秒,短时放回 65°C水浴中(5-10 min),中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。13,000rpm离心10分钟,沉淀不能裂解的碎片。

c.取裂解物上清(在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清,这样可以提高产量)转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。若上清表面有漂浮物,用吸头挑开吸取下面液体即可。

d.立刻接操作步骤的步骤3。

2.液氮研磨法(适用广泛,提取复杂难破碎,易降解样品时推荐此法):
a.液氮中研磨新鲜或-70°C冷冻的材料至细粉。

b.转移100-200mg细粉(水分少的样品如叶片种子等可加100-150mg,水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些)加至预热的裂解液CLB(已加有β-巯基乙醇)离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。

c.短时放回 65°C水浴中(5-10 min),中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。

d.将裂解物13,000 rpm离心10分钟,沉淀不能裂解的碎片。

e.取裂解物上清(在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清,这样可以提高产量)转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。若上清表面有漂浮物,用吸头挑开吸取下面液体即可。

f.立刻接操作步骤的步骤3。

3.将混合物(每次小于720μl,多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中,(清除柱放入收集管中)13,000 rpm离心2分钟,弃掉废液。
确保离心后液体全部滤过去,膜上没有残留,如有必要,可以加大离心力和离心时间。

4.将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内(不用RNAse free 或者DEPC处理,一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管),在基因组清除柱内加500μl裂解液RLT Plus,13,000 rpm离心30秒, 收集滤液(RNA在滤液中),用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常为450-500μl左右,滤过时候损失体积应该减去),加入0.5倍体积的无水乙醇,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。

5.立刻将混合物(每次小于720μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13,000 rpm离心2分钟,弃掉废液。
确保离心后液体全部滤过去,膜上没有残留,如有必要,可以加大离心力和离心时间。

6.加700μl 去蛋白液RW1,室温放置1分钟,13,000rpm 离心30秒,弃掉废液。

7.加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),13,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。

8.将吸附柱RA放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9.取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water(70-90℃水浴加热可提高产量), 室温放置1分钟,12,000 rpm 离心1分钟。

10.如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤9,合并两次洗液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。

附录1:DNA酶柱上消化(2127 DNase I 柱上消化试剂盒说明书)
1.按照前面所列2117试剂盒操作步骤操作,直到做完操作步骤5。

2.取45μl DNase I buffer和5μl RNase free DNase I在离心管轻轻吹打混匀成工作液(处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液)。

3.向吸附柱RA 中加入350μl去蛋白液RW1,12,000 rpm 离心30 秒,弃废液,将吸附柱放回收集管中。

4.向吸附柱RA 中央加入50μl的DNase I 工作液,室温(20℃-30℃)放置15 分钟。注意直接将工作液滴在膜中央上向膜四周浸润充分和膜接触,不要让工作液滴在O型垫圈或是离心柱管壁上挂壁或者挂在垫圈上不能充分和膜接触。

5.向吸附柱RA 中加入350μl去蛋白液RW1, 12,000 rpm 离心30-60 秒,弃废液,将吸附柱放回收集管中。

6.接操作步骤7完成后续步骤。

附录2:RNA含量少样品或者RNA复杂产量低的解决方案
可以提高样品处理量到300-500mg/2ml裂解液CLB,上清过两根基因组DNA清除柱子,洗脱下来的RNA,可以两个合并到一根RNA吸附柱上,可以大大提高RNA浓度。



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2. 专业的引物设计技能,保证qPCR引物的特异性;

3. 熟练的qPCR操作技能,保证完美的qPCR结果;

qPCR实验流程图

送样要求:

1. 细胞(≥106 )、新鲜动植物组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、叶片(≥100mg)等样品材料,基因组DNA或总RNA(总RNA>2μg,体积≥20μl,浓度≥100 ng/μl)。
2. 靶基因信息和背景资料:基因序列或GenBank Accession Number等,生物物种信息(Human、Mouse、Rat 等)、DNA/RNA 来源、基因丰度等。

提供服务:
引物探针设计合成,RNA提取,反转录,RNA电泳,引物筛选,上机定量检测。

提交结果:
原始数据(CT值和各种统计值,融化温度图,扩增曲线图,电泳图,柱状图)、数据分析结果及详细实验报告。